强的松龙纳米微球缓释膜制备及缓释特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.39.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来将强的松龙应用于促进周围神经损伤后功能恢复取得了良好效果，但因半衰期短、局部应用血药浓度不稳定及较大的不良反应限制了其临床应用。
目的：制备强的松龙纳米微球缓释膜并对其药物缓释特性进行检测。
方法：采用反胶束乳化溶剂挥发法制备强的松龙纳米微球，对载药纳米微球的形态、粒径、载药量、包封率和体外释药行为等性质进行研究；同时将纳米微球与胶原、壳聚糖、大豆卵磷脂等膜材相结合，制得复合药膜，考察复合药膜的形貌、膜中材料的相互作用及药膜的体外释药行为。
结果与结论：强的松龙纳米微球具有良好的微观结构，药物均匀分布于纳米微球中，纳米微球粒径均一，表面光滑，平均粒径500 nm，包封率达90%以上，体外缓释实验药物释放良好，存在一定的药物突释现象。观察球膜结合方法制得的复合膜，可见纳米微球均匀分散于复合膜中，复合膜微观结构良好，体外缓释实验见复合膜药物释放更加稳定，无明显药物突释现象出现，显示了良好的药物释放效果。表明通过反胶束乳化溶剂挥发法和球膜结合方法制备出的强的松龙缓释膜剂具有良好的药物缓释特性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

关键词: 生物材料, 缓释材料, 强的松龙, 纳米微球, 缓释膜剂, 周围神经, 药物缓释特性

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, the use of prednisolone has good achievements in functional recovery after peripheral nerve injury, but its short half-life, instable plasma concentrations and greater adverse reactions limit its clinical application.
OBJECTIVE: To prepare prednisolone implantable films and to explore the sustained-release property of prednisolone implantable films.
METHODS: Novel reverse micellar emulsion-solvent evaporation method was used to prepare nanoparticles which contains prednisolone, and we investigated the properties of prednisolone-loaded nanoparticles, including morphological form, diameter, drug loading, encapsulation efficiency, in vitro release properties. Then, composite film was prepared with the nanoparticles above and collagen, chitosan, soybean phosphatidylcholine. The properties of composite films, such as morphological form, the interaction among film materials, in vitro releasing curve, were investigated.
RESULTS AND CONCLUSION: The prednisolone-loaded nanoparticles displayed favorable microstructure such as smooth surface, consistent diameters. The mean diameter of the nanoparticle was 500 nm and the max encapsulation efficiency of the nanoparticle was more than 90%. The nanoparticle displayed obvious sustained-release effect in vitro, but it exhibited a certain burst release phenomenon. We found that the nanoparticles were uniformly distributed inside and on the surface of the composite film; and the in vitro release rate of the film was slower and more stable than the nanoparticles. The composite film displayed favorable sustained-release effect with no burst release. From what we have illustrated above, we can safely come to a conclusion that the prednisolone-loaded film possesses good sustained-release effects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: biocompatible materials, tissue engineering, delayed-action preparations

中图分类号:

R318

李强，林燕玉，齐鹏，沈佳祚，李林，练克俭. 强的松龙纳米微球缓释膜制备及缓释特性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(39): 6342-6347.

Li Qiang, Lin Yan-yu, Qi Peng, Shen Jia-zuo, Li Lin, Lian Ke-jian. Preparation and sustained-release property of prednisolone implantable films[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(39): 6342-6347.

图/表（结果） 9

2.1 强的松龙纳米微球的特性检测

2.1.1 强的松龙纳米微球的大体形态图1为筛选最优条件下制备的强的松龙纳米微球粉末大体形态观察，图中可见制得的纳米微球以粉末结晶形式存在，经超声乳化及冷冻干燥机干燥后，纳米微球较分散，有利于下一步其与复合膜的结合。

图2为强的松龙纳米微球的扫描电镜和透射电镜下照片；从扫描电镜图中可见，强的松龙纳米微球为表面圆滑的球形结构，大体估算及比例尺测量见纳米微球的粒径均匀，分布范围为350-800 nm之间，平均粒径为500 nm，各纳米微球分布均匀；透射电镜照片上可见纳米微球质地均一，无明显的分层现象出现，间接说明药物均匀的分布于纳米微球之中。

2.1.2 强的松龙药物标准曲线的测定图3为强的松龙在DMSO溶剂中浓度与吸光度相关关系的标准曲线图，图中可见强的松龙标准曲线具有良好的线性关系，方程为y=0.050 4x+0.007 8，r²=0.993 7(y：吸光度，x：强的松龙浓度，r²为线性相关系数)，由此方程式可以通过测定药物在245 nm处的吸光度值来估计强的松龙药物的浓度。

2.1.3 强的松龙纳米微球的载药量、包封率和体外释药曲线利用上述载药率及包封率计算公式得出本实验中制得强的松龙纳米微球的载药率和包封率分别为7.67%和89.64%。图4为强的松龙纳米微球的体外药物释放曲线，图中可见强的松龙纳米微球实现了药物的缓慢释放，在 30 d内药物释放量达90%以上，缓释效果明显；但是在药物释放的前24 h内药物释放量较大，释药量达30.16%，存在药物突释现象。

2.2 强的松龙在磷脂复合物中的存在状态图5为X射线衍射分析分析结果，图中a曲线显示，强的松龙药物主要以晶体形式存在，在10°< 2θ < 25°衍射范围内出现多处强结晶衍射峰；b曲线可见大豆软磷脂无明显结晶衍射峰出现，仅为一条光滑的曲线；c曲线可见强的松龙与大豆软磷脂物理混合后，强的松龙的结晶衍射峰仍然存在，且无新的结晶衍射峰生成，但是强的松龙的各衍射峰值均出现了不同程度的降低，表明大豆软磷脂的加入减弱了强的松龙的晶体存在状态；d曲线可见，强的松龙磷脂复合物中，强的松龙的晶体衍射峰完全消失，只展现出了一条光滑的曲线，与大豆软磷脂的衍射曲线相类似，显示了强的松龙磷脂复合物中强的松龙的存在状态是与大豆软磷脂相结合，而不是以自己本身的晶体状态存在。

2.3 强的松龙纳米微球缓释膜的形态学考察 图6为制得的纳米微球缓释膜的照片，图中可见制得的缓释膜光滑平整，厚度均一，具有较好的柔韧性及吸水性能。图7为强的松龙缓释药膜不同阶段的扫描电镜图片，其中a₁、b₁、c₁分别为单纯胶原膜、胶原与磷脂复合膜及强的松龙纳米微球缓释膜的纵切扫描图；a₂、b₂、c₂分别为上述各膜的剖面图。从图a₁、a₂中可见，单纯胶原膜表面致密，有大量交错的纤维结构组成，剖面图可见胶原膜内部由层状组织组成，层状组织间有空隙；图b₁、b₂所示为胶原与磷脂的复合膜，图中可见与单纯胶原膜相比磷脂复合膜的表面纤维样组织不明显，质地更加光滑致密，剖面图可见胶原膜层与层之间的空隙被磷脂组织填充，更加光滑致密，使胶原膜的生物学特性更佳，有利于药物的持续缓慢释放。图c₁、c₂为强的松龙纳米微球缓释膜，图中可见少量的纳米微球附着于缓释膜的表面，这与该药膜体外释放试验中少量的药物突释现象有关，剖面图可见胶原与磷脂复合膜的结构未见明显改变，纳米微球均匀分布于复合膜中，周围由磷脂组织填充；由图中可看出，强的松龙药物首先从药膜表面附着的纳米微球中释放，后随着胶原磷脂复合膜的降解，复合膜内部的纳米微球逐渐降解，将药物从膜中释放出来；复合药膜的致密结构有利于纳米微球的持续缓慢释放。

2.4 强的松龙纳米微球缓释膜的结构分析 图8可见以胶原膜主要膜材料制成的强的松龙纳米微球缓释膜与单纯胶原膜相比各衍射峰未见明显改变，各结晶峰值的位置几乎与胶原膜相同，但其结晶强度有所减弱，这说明以胶原作为强的松龙复合膜的主要材料并未改变胶原膜原本的结构，其衍射峰值减弱的原因可能为壳聚糖和软磷脂的加入掩盖了胶原膜部分结晶强度，但胶原膜原本性质未变。

2.5 强的松龙纳米微球缓释膜体外释药行为 图9为强的松龙纳米微球缓释膜的体外药物释放曲线，从图中可见，纳米微球缓释膜在60 d的时间内释放了其载药量的75%，在 30 d时其药物的释放量达到60%以上，具有明显的药物缓释效果，且药物释放量较单纯的纳米微球更加稳定、持久；其中纳米微球缓释膜在最初24 h内药物的释放量为8.06%，未出现明显药物突释现象，与单纯纳米微球相比(图4)，药物释放更加平稳，具有良好的体外药物释放作用。

参考文献

[1]Silver J,Miller JH.Regenerat ion beyond the glial scar. Nat Rev Neurosci.2004;5(2):146-156.
[2]Fenrich K,Gordon T.Canadian Associat ion of Neuroscience review: axonal regener at ion in the peripheral and central nervous systems--current issues and advances.Can J Neurol Sci.2004;31(2):142-156.
[3]党育,姜保国,张殿英,等.甲基泼尼松龙局部应用对周围神经损伤修复后的形态学研究[J].中华手外科杂志,2005,21(5):314-316.
[4]王晓波.药物运释系统[M].北京:中国医药科技出版社,2007.
[5]Cui F,Shi K,Zhang L,et al.Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. JControlled Release.2006;114(2):242-250.
[6]Ozgenel GY. Effects of hyaluronic acid on peripheral nerve scarring and regenerat ion in rats. Microsurgery. 2003;23(6): 575-581.
[7]Yates JM,Smith KG,Robinson PP.The effect of triamcinolone hexacetonide on the spontaneous and mechanically-induced ectopicdischarge following lingual nerve injury in the ferret. Pain.2004;111:261-269.
[8]Azuma C,Tohyama H,Nakamura H,et al.Antibody neutralization of TGF-beta enhances the deterioration of collagen fascicles in a tissue-cultured tendon matrix with ex vivo fibroblast infiltration.J Biomech.2007;40(10):2184-2190.
[9]赵永青,苏衍萍,韩凤岳.甲基强的松龙对急性脊髓损伤神经元保护作用的实验研究[J]. 中华神经外科杂志,2005,21(6):367-370.
[10]He YC,Chen JW,Cao J,et al.Toxicities and therapeutic effect of 5-fluorouracil controlled release implant on tumor-bearing rats.World J Gastroenterol.2003;9(8):1795-1798.
[11]Li YW,Duc LH,Tyler B,et al.In vivo delivery of BCNU from a MEMS device to a tumor model.J Controlled Release. 2005; 106(1-2):138-145.
[12]Wang FJ,Wang CH.Etanidazole-loaded microspheres fabricated by spray-drying different poly(lactide/glycolide) polymers: effects on microsphere properties. J Biomater Sci Polym Ed.2003;14(2):157-183.
[13]Chang MC,Ko CC,Douglas WH.Preparation of hydroxyapatite-gelatin nanocomposite. Biomaterials. 2003;24(17):2853-2862.
[14]Liu H,Mao J,Yao K,et al.A study on a chitosan-gelatin- hyaluronic acid scaffold as artificial skin in vitro and its tissue engineering applications. J Biomater Sci Polym Ed. 2004;15: 25-40.
[15]Harada O.Collagen-based new biomedical films: synthesis, property and cell adhesion.J Appl Polym Sci. 2001;81: 2433-2438.
[16]Ann LD,Jeffrey LC,Eileen MD,et al.Pharmacological modulation of the tissue response to implanted poly lactic-co-glycolic acid microspheres. Eur J Pharm Biopharm. 1997;1637(44):89-102.

引言

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：实验于2013年6月在厦门大学生物医学工程中心完成。

实验方法：

强的松龙纳米微球的制备：以反胶束乳化溶剂挥发法制备强的松龙纳米微球^[5]。在DMSO溶液中加入适量强的松龙和大豆卵磷脂，不停搅拌使其溶解形成均一透明的溶液，在-40 ℃冷冻干燥机中使其干燥制成磷脂复合物；在制得的磷脂复合物中加入聚乳酸羟基乙酸溶液(溶剂为二氯甲烷)充分搅拌，使其成为质地均匀的反胶束溶液，形成油相。然后将上述反胶束溶液加入聚乙烯醇溶液(4 ℃、0.25%)中高速搅拌(6 000 r/min)，使其成为稳定均一的O/W型乳化溶液，室温下低速搅拌4 h除去二氯甲烷， 10 000 r/min离心收集纳米微球。将收集的纳米微球水洗3次后置于冷冻干燥中得到白色粉末，低温密闭储存。同法制备不加入强的松龙的空白纳米微球。

强的松龙纳米微球大体形态观察：通过扫描电子显微镜观察强的松龙纳米微球的大体形态，在洁净的硅片上利用超声分散方法将纳米微球悬浮液分散，使其自然干燥；干燥后对样品在真空条件下进行表面喷金，时间约25 s，扫描电镜观察；同样方法将上述样品超声分散后滴在300目的铜网上自然干燥，置于透射电镜下观察。

纳米微球X射线衍射分析：分别对强的松龙、大豆软磷脂、两者的物理混合物和磷脂复合物进行X射线衍射分析，观察强的松龙与大豆软磷脂形成磷脂复合物后的变化情况。

强的松龙溶液标准曲线的测定：紫外分光光度计分别测定在254 nm波长处2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 g/mL强的松龙PBS缓冲液(pH 7.2)和DMSO溶液的吸光度值，制成强的松龙标准曲线。

强的松龙纳米微球载药量和包封率的测定：利用上述强的松龙标准曲线，准确测量等量强的松龙纳米微球和空白纳米微球，分别溶于DMSO中，测定在254 nm处两者的吸光度值，代入标准曲线公式计算出强的松龙的浓度，利用下述公式计算出强的松龙纳米微球的载药量和包封率：

载药量=强的松龙的含量/纳米微球的质量×100%

包封率=实际载药量/理论载药量×100%

载药纳米微球的体外释放实验：在透析袋内加入 10 mg强的松龙纳米微球，将袋口扎紧后置于PBS(pH 7.2)中，在37 ℃、72 r/min条件下的恒温振荡，每日定时取样，并立即补加相同量的PBS(pH 7.2)。测定该样品在254 nm处吸光度值，计算强的松龙的药物释放浓度。

强的松龙纳米微球缓释膜的制备：取强的松龙纳米微球超声分散于PBS(pH 7.2)中备用；将适量胶原溶解在PBS(pH 7.2)，壳聚糖溶解于1%醋酸溶液中，大豆软磷脂溶解于热乙醇溶液中，将上述3种溶液按一定比例混均后将强的松龙纳米微球溶液加入混合均匀，低速离心脱气泡后，倒入聚四氟乙烯圆盘中放入37 ℃烘箱中烘干，即得强的松龙纳米微球缓释膜。同样的方法制备不含强的松龙的空白缓释膜。

强的松龙纳米微球缓释膜的微观形态观察：取强的松龙纳米微球缓释膜，进行扫描电镜观察，了解其微观结构。

强的松龙纳米微球缓释膜中各材料相互作用：利用X射线衍射方法对缓释膜中各材料相互作用进行检测，对照组为单纯胶原膜，X射线衍射扫描范围2θ=5°-60°，扫描速度0.4 (°)/min。

强的松龙纳米微球缓释膜的体外释放实验：在透析袋内加入10 mg强的松龙纳米微球缓释膜，同时袋内加入少量含Ⅰ型胶原酶的PBS(pH 7.2)，将袋口扎紧后置于PBS(pH 7.2)中，在37 ℃、72 r/min条件下恒温振荡，每日定时取样，并立即补加相同量的PBS(pH 7.2)。测定该样品在254 nm处吸光度值，计算强的松龙药物释放浓度。

主要观察指标：强的松龙纳米微球缓释膜的形貌、膜中材料的相互作用及药膜的体外释药行为。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

讨论

周围神经损伤后神经断端瘢痕的形成阻碍了神经功能的恢复^[6]，强的松龙以其强大的抗炎作用在临床上得到了广泛应用，目前大量研究将其应用于神经断端促进神经功能的恢复，取得了良好的效果^[7-9]，本课题前期实验也表明强的松龙具有良好促进神经功能恢复的效果。但强的松龙药物半衰期短、局部用药药物浓度不稳定及药物的不良反应阻碍了其在周围神经损伤领域的应用。
本课题借鉴目前肿瘤治疗过程中常用的纳米微球技术^[10-11]，应用反胶束乳化溶剂挥发法制备出强的松龙纳米微球，对纳米微球各项性质进行检测。实验中制得的强的松龙纳米微球具有良好的微观结构，质地均匀，粒径分布范围为350-800 nm之间，平均粒径为500 nm，强的松龙药物均匀的分布于纳米微球之中。在对强的松龙纳米微球的体外药物释放实验中发现，纳米微球具有明显的药物缓释作用，30 d内药物释放量达到90%左右，后期能够实现药物的稳定释放；但强的松龙纳米微球在最初的24 h内存在药物突释现象。作为药物基本载体的强的松龙纳米微球，其使用的最终目的是能够实现目标药物的长期、稳定及局部的定位释放；其中评价载药纳米微球缓释效果的重要指标为纳米微球的载药量和体外药物释放性能。本实验中强的松龙纳米微球的体外药物释放初期存在明显药物突释现象，分析其原因可能为载药纳米微球表面所吸附的药物，或与载药纳米微球不能很好结合的部分药物在短时间内从微球表面脱落造成^[12]，此阶段虽然在药物释放初期的短时间内发生且持续时间很短，但却是载药纳米微球药物释放过程中不可忽略的重要阶段。本部分实验所制得的强的松龙纳米微球24 h内存在明显的药物突释现象，短期内药物释放剂量有可能超过致死剂量，这不得不引起人们的重视。

鉴于强的松龙纳米微球的药物突释现象及后续实验还要满足强的松龙应用于周围神经损伤断端的需要，在下一步实验中引入了球膜结合的技术，以胶原膜作为强的松龙纳米微球的主要载体^[13]，利用胶原膜的物理阻隔等方式来减少纳米微球对药物的突释，实现了药物的持久稳定释放，以达到抑制周围神经损伤后神经内瘢痕的产生，最大可能的实现存进周围神经损伤后神经功能恢复的目的。

本实验利用球膜结合的方法制备的强的松龙纳米微球缓释膜具有良好的膜内微观结构，缓释膜中各材料均保持原有的生物学特性，载药纳米微球均匀分散于复合膜的表面及内部，并通过壳聚糖和大豆卵磷脂的加入对胶原的生物学特性进行了优化^[14]，显著改善了原有胶原膜的药物缓释及体内降解特性^[15]，使强的松龙纳米微球缓释膜的体外释药特性更加平稳，明显减少了药物的突释现象，60 d内药物的累计释药率为75%左右，呈现了良好的缓释效果。

本部分实验中利用可生物降解的胶原和聚乳酸羟基乙酸材料制成的复合药膜，可使药物的释放达到或近似达到一级或零级释放^[16]，消除了因间歇给药及用药量不均匀所产生的药物峰谷现象，可应用于局部组织，稳定、持续、缓慢的释放药物，维持药物浓度稳定，从而减少了药物应用剂量，降低了大量应用药物所带来的不良反应。同时该缓释膜可直接应用于局部，不存在药物的吸收障碍，可直接作用于靶组织，发挥药理作用，提高了药物药效，进一步减少了药物应用剂量。同时在药物缓慢释放过程中该膜可逐渐降解被人体吸收而排出体外，无需二次手术，从而提高了患者的依从性。该复合药膜显著延长了强的松龙的半衰期，极大减少了强的松龙的药物不良反应，使强的松龙局部应用于抑制周围神经损伤后瘢痕的形成成为了可能，具有其他药物载体制剂不可替代的优点。但是该缓释膜能否应用于动物体内尚需生物学安全性及体内药物缓释特性的检测，有待于进一步的深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
全文链接：